e:Med - Modul II - Verbundprojekt: MitoPD - Mitochondriale Endophänotypen der Parkinson Krankheit - Teilprojekt D

Schwerpunkt des TP4 liegt darin, spezifische Vorhersagen zu testen und zu validieren, die mittels rechnergestützter Modellierung (TP3) in zellulären Modellen und menschlichem Material (PBMCs, Fibroblasten, iPSCs) generiert wurden. Diese Rechenmodelle bilden die Grundlage für die erste Stufe der Validierung mittels high-content/ high-throughput Analysen verschiedener Aspekte der mitochondrialen Funktion in zellulären Patientenmodellen (aus TP1). 1a Für Gene bzw. molekulare Kaskaden, die durch rechnergestützte Modellierung im TP3 als dereguliert identifiziert wurden, werden Bibliotheken mit Vektoren generiert, die diese Überexprimieren oder Expression supprimieren. 1b Die Plasmid-DNA aller Vektoren wird anschließend für die Herstellung von Lentiviren verwendet (96-Lochplatten-Format). 2a Patienten- und isogene iPSCs werden kultiviert und in dopaminerge Zellen differenziert. Die weitere Kultivierung erfolgt durch ein automatisiertes Zellkultursystem. 2b iPSCs werden mit Lentiviren (knock-down und over-expression) transduziert, um die Hypothesen aus TP 3 zu validieren. 3a Differenzierte iPSCs werden mit verschiedenen mitochondrialen Markern gefärbt und mittels automatisiertem live cell imaging am konfokalen Mikroskop hinsichtlich mitochondrialer Morphologie, Funktion und Transport analysiert. 3b Die Zellen werden fixiert und mit Immunfärbungen auf weitere krankheitsrelevante Phänotypen hin untersucht. 4 Datenanalyse und Validierung der Kaskaden.