Transcan III - Verbund: HLA-Ligandomanalyse von ATRT-Tumorgewebeproben

Die von den klinischen Kollaborationspartnern aquirierten ATRT-Tumorgewebeproben werden mit Detergens lysiert. Die enthaltenen HLA-Moleküle weren mittels Antikörpern isoliert. Die mit den HLA-Molekülen nicht-kovalent assoziierten Peptide (also die HLA-Liganden) werden durch saure Extraktion mittels Triflouressigsäure (TFA) eluiert, per hochauflösender Chromatographie (HPLC) aufgetrennt, durch ein direkt an die HPLC-Säule angeschlossenes Massenspektrometer identifiziert und schließlich durch Abgleich mit öffentlichen Datenbanken ihren Ursprungsgenprodukten zugeordnet. Erwartet werden zwischen 1 000 und 5 000 unterschiedliche Peptide aus zellulären Proteinen der Tumorzellen. Durch Vergleich mit unserer hausinternen Datenbank mit HLA-Liganden aus Normal- und Tumorgewebeproben, die derzeit über 85 000 unterschiedliche Peptide aus ca. 15 000 Quellproteinen enthält, werden diejenigen selektioniert, die den Kriterien für eine mögliche Verwendung zu einer therapeutischen Vakzinierung entsprechen. Die entsprechenden Peptide werden wir synthetisieren und den Kollegen vom WP2 zur Verfügung stellen. DDie Tumorgewebeproben werden einzeln der HLA-Ligandomanalyse unterzogen, wobei im Haus hergestellte Antikörper gegen HLA-A,B,C (Klon W6/32) verwendet werden. Die erhaltenen Datensätze werden zunächst vorvalidiert. Die annotierten Peptide werden über HLA-Spezifitätsalgorithmen, insbesondere das von uns entwickelte SYFPEITHI -Werkzeug , den HLA-Allelprodukten der Patienten zugeordnet. Die erhaltenen Peptidlisten werden mit unserer vorhandenen Datenbank von HLA-Liganden und deren Quellproteinen verglichen, um Kandidatenpeptide für eine therapeutische Vakzinierung zu selektionieren. Die so gefundenen Peptide müssen dann durch Vergleich mit neu synthetisierten isotopenmarkierten Peptiden endgültig validiert werden. Die letztendlich ausgewählten Peptide werden dann nochmals unmarkiert synthetisiert, um diese dem WP2 zu übergeben.