E-Rare Verbund: Neue Therapieansätze für Multiple Systematrophie mit Ansatzpunkt Alpha-Synuclein

In diesem Teilprojekt soll der Effekt der Kombination verschiedener Strategien (verstärkte Autophagie, Hemmung der alpha-Synuclein-Aggregation, Immuntherapie) in-vitro untersucht werden. Dafür wird der Effekt aller Compound-Kombinationen auf Zell-Viabilität und alpha-Synuclein-Aggregation in einem oligodendroglialen Zellkultur-Modell untersucht, in dem induzierbar verschiedene alpha-Synuclein-Varianten exprimiert werden. Dieses Zellmodell ermöglicht ein schnelles Screening des Effekts der Kombination von zwei oder mehr zuvor getesteten Strategien und eine detaillierte quantitative Analyse möglicher synergistischer Effekte basierend auf Dosis-Wirkungs-Kurven. Dadurch sollen entscheidende Informationen für die Auswahl der beiden vielversprechendsten Kombinationen für die folgende in-vivo-Untersuchung gewonnen werden. Die Auswahlkriterien basieren hierbei auf verringerter alpha-Synuclein-Aggregation und erhöhter Zell-Viabilität. Oligodendrogliale Zellen werden stabil mit lentiviralen Vektoren transduziert, die Konstrukte in die Zellen einbringen, die entweder eine stabile oder induzierbare Expression von Zielgenen ermöglichen. Durch Verwendung von bimolekularer Fluoreszenzkomplementation können alpha-Synuclein-Oligomere mittels Fluoreszenzmikroskopie visualisiert werden. Aggregation wird durch Überexpression, Exposition zu Metall-Ionen und mitochondrialen Toxinen, sowie durch Seeding von sowohl artifiziellen als auch aus Gehirnen gewonnenen alpha-Synuclein-Aggregaten induziert. Die Kinetik der Oligomer-Bildung wird mittels Fluoreszenz-Mikroskopie (OPERA-System), Einzelmolekülspektroskopie von Zelllysaten (Insight-System) und biochemischen Techniken (Sucrose-Gradienten-Zentrifugation) untersucht. Neben alpha-Synuclein-Aggregation und Zell-Viabilität bietet dieses Modell die Möglichkeit weiterer Read-Outs, beispielsweise mitochondriale Dysfunktion, oxidativer Stress, Apoptose und Unfolded Protein Response.