ERA-NET EuroTransBio-10: MetaDiC - Unter Verwendung eines neuartigen Verfahrens werden gezielt krebsrelevante Gene in patientenabgeleiteten Pankreastumorzelllinien ausgeschaltet. Ziel ist es ein Modellsystem zur Wirkstoffentwicklung und Suche nach diagnostischen Biomarkern zu entwickeln.

Ziel der am NMI durchgeführten Arbeiten ist die zielgenspezifische, CRISPR/Cas9-basierte genomische Editierung von patientenabgeleiteten Pankreaskrebszelllinien. Der Knockout jedes ausgewählten Zielgens wird auf Genom- und Protein-Ebene validiert. Das NMI wird Auswirkungen der Zielgen-Knockouts sowie von Wirkstoffbehandlungen auf Signaltransduktionsprozesse dieser Zelllinien untersuchen, um neue Ansatzpunkte für alternative Therapien von Pankreastumoren zu identifizieren. Zur Verringerung von off-target Effekten wird die "paired nickase" Strategie zur Generierung von CRISPR-Knockout-Zelllinien eingesetzt. Dazu wird die Cas9D10A Nickase stabil in einen "safe harbor"-Lokus des Genoms von 5 etablierten und 5-10 patientenabgeleiteten Pankreastumorzelllinien integriert. Dann werden unter Verwendung web-basierter Plattformen für 3 ausgewählte Zielgene jeweils 5 gRNA Sequenzpaare identifiziert und in Expressionsvektoren kloniert. Nach Sequenzvalidierung werden diese Konstrukte transient in die Cas9D10A-Pankreaskrebszelllinien transfiziert. Durch limiting dilution werden Einzelzellklone generiert und per PCR auf erfolgreichen Zielgen-Knockout gescreent. In positiven Klonen wird der Knockout auf Proteinebene sowie per Sequenzierung bestätigt. Die hergestellten Knockout-Zelllinien werden von den Verbundpartnern zur Herstellung und Wirkstoffbehandlung von CRISPR-Organoid- und Xenograft-Modellen eingesetzt. Das NMI wird in diesen unterschiedlich behandelten Modellen unter Einsatz der qRT-PCR-Array-Plattform (Quantstudio 12K Flex OpenArray, Life Technologies) Expressionsprofile von 896 Genen bestimmen und analysieren. Die erhaltenen Daten sind von entscheidender Bedeutung bei der Charakterisierung von Knockout-induzierten Veränderungen der Signaltransduktion, welche Unterschieden der Knockout-Modelle beim zellulären Phänotyp und bei der Sensitivität gegenüber Substanzbehandlungen zugrunde liegen.